Ciclo Celular – Fase S

A replicação do DNA é um dos momentos mais importantes do ciclo celular – saiba todos os detalhes a seguir.

A duplicação do DNA na subfase S é um evento muito importante do ciclo celular, pois garante que as células-filhas possam receber uma cópia exata de cada molécula de DNA da célula parental. As células humanas diploides, por exemplo, tem 2n = 46 cromossomos; portanto, uma célula em G1 é constituída por 46 moléculas de DNA (uma molécula para cada um dos 23 pares de homólogos). Durante a fase S, cada molécula de DNA dá origem à outra idêntica a ela, de tal forma que, em G2, a célula humana contém 92 moléculas de DNA, sendo que um dos 46 cromossomos contém duas moléculas de DNA (denominadas cromátides-irmãs) que se mantém associadas por complexos proteicos denominados coesina. Essas células continuam diploides, tendo 2n = 46 cromossomos, embora com o dobro do conteúdo de DNA. As subfases S e G2 ocorrem somente em células que irão se dividir e, na maioria, têm duração relativamente constante, de sete a oito horas para S e de duas a cinco horas para G2. A duplicação de DNA na interfase pode ocorrer também em células que contém cromossomos politênicos e em células poliplóides.

 

fases do ciclo celular

Períodos discretos da intérfase.

A SÍNTESE DE DNA OCORRE NA FASE S DA INTERFASE

Ainda que a mitose constitua morfologicamente a etapa mais espetacular do ciclo celular, é na interfase que ocorre a duplicação dos componentes da célula-mãe, bem como, em especial, a duplicação do DNA, pré-requisito essencial para que a divisão ocorra. Esse processo pode ser estudado por meio do emprego de precursores radioativos, utilizando-se de métodos bioquímicos ou radiofármacos, ou por citofotometria.

Quando precursores radioativos do DNA, como a timidina tritiada (timidina-H³), são dados às células por poucos minutos e estas são então processadas para radioautografia, pode-se observar, ao microscópio óptico, que células em divisão não incorporam a timidina-H³. Por outro lado, células que estavam replicando o DNA no momento da exposição à timidina-H³ produzem a imagem radioautográfica de núcleos marcados, verificando-se que apenas algumas células em interfase estavam replicando seu DNA.

A observação, a intervalos de tempo fixos posteriores à exposição, para detectar o momento em que o bloco de células marcadas entra em mitose, permite demonstrar, entre outros aspectos, que as células terminam a replicação do DNA pelo menos 2h antes da mitose. Portanto, nas células eucariontes, a duplicação do DNA está situada em um período intermediário da interfase e não ocupa toda essa fase. Essa descoberta possibilitou a divisão da interfase em 3 períodos sucessivos, ou a divisão do ciclo em quatro fases distintas, que foram chamadas G1, S, G2 e M. No período S ocorre a duplicação ou síntese do DNA, daí o nome dessa fase. A abreviatura G provém do termo inglês gap (intervalo). O período G1 é o intervalo de tempo que transcorre desde o fim da mitose (M) até o início da síntese de DNA (S), por isso é também considerado período pós-mitótico ou pré-sintético. O período G2 é o intervalo entre o término da síntese de DNA e a próxima mitose, também denominado período pós-sintético ou pré-mitótico. 

 

PERÍODO S

O início da síntese de DNA marca o início do período S e, na grande maioria dos casos, é um ponto de não retorno do ciclo, que leva necessariamente à divisão celular. Durante o período S, a célula duplica seu conteúdo de DNA, elaborando réplicas perfeitas das moléculas de DNA que contém. Esse processo denomina-se replicação. Toda célula eucarionte diploide inicia seu ciclo em G1 com uma quantidade de DNA igual e 2C. Durante o período S, essa quantidade duplica, passando de 2C para 4C, e assim permanece até a fase do ciclo em que é igualmente repartida para as duas células-filhas, as quais voltam a ter, novamente em G1, a quantidade 2C idêntica à da célula de origem.

A replicação do DNA em células eucariontes guarda estreito paralelismo com a replicação de células procariontes. Por isso, o mecanismo de duplicação do DNA tem sido estudado, de preferência, nas células mais simples, como a bactéria Escherichia coli. No entanto, ainda que os resultados obtidos nessa célula procarionte sejam, na essência, válidos também para as células eucariontes, o processo nos eucariontes é muito mais complexo. Células eucariontes têm um genoma enorme, que deve ser duplicado com alta fidelidade uma única vez a cada ciclo celular, e isso deve ser feito dentro de pouco tempo, nas poucas horas ocupadas pelo período S. Soma-se isso ao fato de que, em células eucariontes, o DNA nuclear apresenta-se na forma de fibras de cromatina, formando um complexo com proteínas histonas. Portanto, é a cromatina que deve sofrer duplicação no período S, o que exige que não só o conteúdo de DNA seja duplicado, mas também a quantidade de histonas. Contrariando o que acontece com todas as demais proteínas celulares, as histonas são as únicas proteínas cuja síntese está confinada à fase S, ocorrendo simultaneamente com a síntese de DNA.

É neste período também que os primórdios de novos centríolos (chamados pró-centríolos) são observados, formando-se perpendicularmente a cada membro do par de centríolos existentes nas células.

 

A REPLICAÇÃO DO DNA É SEMI-CONSERVATIVA

Com base na molécula de DNA proposto por Watson e Crick, o mecanismo básico de replicação envolve a separação das cadeias de DNA, obtida pelo desenrolamento da dupla hélice, seguido pela cópia de cada cadeia, que serve como um molde para a síntese de uma nova cadeia complementar. A sequência de nucleotídeos da nova cadeia é fixada pelas regras de pareamento de bases, propostas por Watson e Crick. O correto pareamento das bases assegura uma replicação acurada da dupla hélice original.

Durante a replicação, as duas fitas do DNA original, também chamadas de parentais, são copiadas, originando duas moléculas-filhas, cada qual com somente uma das fitas recém-sintetizada. Diz-se, portanto, que a replicação é semiconservativa. Assim, cada nova molécula de DNA é cópia perfeita de uma molécula preexistente.

A replicação semiconservativa do DNA pode ser estudada por radioautografia, utilizando-se timidina-H3. Pode ainda, ser estudada usando-se um análogo estrutural da timidina, a 5’-bromo-desoxiuridina, que se incorpora ao DNA em substituição àquela base, no momento da replicação. A presença desse análogo na molécula de DNA pode ser detectada pela coloração diferencial nas cromátides-irmãs em cromossomos que alcançam a segunda mitose após a incorporação.

dna-transcricao traducao e duplicacao

 

CARACTERÍSTICAS GERAIS DA REPLICAÇÃO DO DNA

Uma análise detalhada da duplicação do DNA demonstrou que a incorporação de precursores marcados, seja timidina-H3 ou o análogo da timidina, bromo-desoxiuridina, não se dá ao mesmo tempo em todas as moléculas de DNA de um núcleo, e que dentro de uma molécula, existe um padrão determinado de sequência de síntese; por isso se diz que a duplicação do DNA é assíncrona. Dentro de um dado tipo celular, regiões específicas do material genético, ou genes individuais, começam e terminam sua duplicação em momentos definidos na fase S. A eucromatina, que constitui a cromatina geneticamente ativa, começa a replicar primeiro, fazendo-o desde o início da fase S, enquanto a heterocromatina geralmente é a última a replicar, no final do período S, sendo considerada, portanto, de replicação tardia.

A velocidade de duplicação do DNA é calculada em torno de 30 mm por minuto, na Escherichia coli, e de 0,5 a 2,0 mm por minuto (ou o mesmo que 3.000 bases/min) nos núcleos das células eucariontes dos vertebrados. Com essa velocidade, se o processo começasse por um extremo da molécula de DNA e terminasse no outro, o genoma dos vertebrados gastaria um tempo muito longo para a sua replicação. Calcula-se que seria necessário 1 mês para um cromossomo humano replicar. Mas, isso realmente não acontece, e foi possível demonstrar que, enquanto em células procariontes a molécula de DNA inicia a replicação em um único local, chamado origem de replicação, em células eucariontes existem múltiplas origens. Assim, essas células solucionaram o problema de replicar seu enorme genoma no curto espaço de tempo de S e superaram a baixa velocidade de sua replicação. O número de origens de replicação depende do organismo, do tipo celular e é regulado ao longo do desenvolvimento. Esse número pode ser de uma origem a cada 3 ou 300 kpb (3 mil ou 300 mil pares de bases). Como exemplo, em um cromossomo humano médio existem, pelo menos, 200 pontos de origem. Como muitos genes ativos replicam no início da fase S, é possível que o papel de origens de replicação específicas seja o de coordenar a replicação do DNA com a transcrição dos genes.

Células eucariontes, ao iniciarem a replicação em várias origens, apresentam então muitas unidades de replicação distribuídas ao longo do genoma, as quais se denominam réplicons. Em cada núcleo de mamífero existem 20.000 a 30.000 réplicons. As unidades de replicação que iniciam simultaneamente a síntese de DNA constituem as chamadas famílias de réplicons (em inglês, replicon clusters), e diferentes famílias destas iniciam em diferentes tempos.

Cabe ressaltar que, a cada fase replicativa, todas as unidades de replicação do genoma nuclear são replicadas e que cada réplicon replica somente uma vez, dentro de um único período S. Um complexo enzimático isolado de leveduras, chamado complexo de reconhecimento de origem (ORC, em inglês), liga-se às origens de replicação e sinaliza para que outras proteínas reguladoras venham a se ligar também. Entre estas proteínas, está um grande complexo proteico, o complexo pré-replicativo ou pré-RC. Quando o complexo pré-RC liga-se a uma origem de replicação, o complexo ORC é fosforilado e o processo de replicação é iniciado. Depois de corrida a replicação, o complexo pré-RC se desliga daquela origem de replicação, impedindo outra leitura da mesma origem.

 

A REPLICAÇÃO É BIDIRECIONAL

Uma vez iniciada a replicação em cada ponto de origem, ela se propaga para os dois lados da molécula de DNA, ou seja, em ambas as direções, até encontrar, em qualquer ponto, os extremos das cadeias em formação dos réplicons adjacentes. A esse movimento para lados opostos se denomina replicação bidirecional. Estudos radioautográficos ao microscópio eletrônico do cromossomo de E. coli em divisão mostraram que a incorporação de timidina-H³ ocorre principalmente onde os dois filamentos de DNA da dupla hélice se separam. Esses locais têm a forma da letra Y e são chamados de forquilhas de replicação. A replicação bidirecional envolve duas forquilhas que se movem em direções opostas.

 

A REPLICAÇÃO É SEMIDESCONTÍNUA

A radioautografia demonstra também que as duas cadeias parentais da dupla hélice vão, ambas, sendo replicadas em cada forquilha de replicação que avança. A enzima responsável pela polimerização dos desoxirribonucleotídeos na síntese do DNA, a DNA-polimerase, polimeriza somente na direção 5’-3’, e, então, ambas as cadeias-filhas devem ser sintetizadas na direção 5’-3’. Mas, os dois filamentos de DNA da hélice dupla são antipararelos, isto é, um deles tem a direção 5’-3’ e o outro a direção contrária.

Tomando como referência o sentido do movimento da forquilha de replicação, a cópia da cadeia parental 3’-5’pode ser sintetizada continuamente. Essa cadeia-filha que avança na direção 5’-3’, recebe o nome de cadeia líder ou cadeia contínua (em inglês, leading strand). A outra cadeia parental, 5’-3’ tem de ser copiada de um modo intermitente, descontínuo, por meio da síntese de uma série de fragmentos, que depois de unidos dão origem a uma cadeia denominada cadeia retardatária ou cadeia descontínua (lagging strand). Os fragmentos da cadeia descontínua receberam o nome de fragmentos de Okazaki e são cadeias curtas com um comprimento aproximadamente constante de 1000 a 2000 nucleotídeos de E. coli e de 200 a 300 nucleotídeos em células eucariontes.

 

A REPLICAÇÃO DO DNA É REALIZADA POR ENZIMAS

Tanto as células procariontes como as eucariontes têm enzimas denominadas DNA-polimerases (DNApol), capazes de sintetizar DNA a partir de seus precursores. Para catalisarem essa síntese, os precursores de DNA devem estar presentes sob a forma de trifosfatos de desoxirribonucleosídios ou desoxirribonucleotídios trifosfatados. Os quatro desoxirribonucleotídios trifosfatados necessários para a síntese de DNA são dATP, dCTP, dTTP e dGTP, contendo as bases adenina (A), citosina (C), timina (T) e guanina (G), respectivamente. Além de serem moléculas estruturais, esses desoxirribonucleotídeos proporcionam energia para a síntese dos novos filamentos de DNA, porque, enquanto são precursores, estão trifosfatados, mas quando incorporados na nova cadeia do DNA são apenas na forma de monofosfatos. A ruptura das ligações fosfato excedentes fornece a energia necessária para a síntese de DNA. Simultaneamente, fosfato inorgânico é liberado. Todas as DNA-polimerases descobertas até hoje obedecem às seguintes propriedades:

  • cada desoxirribonucleotídio a ser incorporado é selecionado de modo que sua base nitrogenada seja complementar e possa então parear com bases da cadeia molde, sempre fazendo pareamentos AT e GC. Portanto, a sequência de bases na nova molécula de DNA depende exclusivamente da sequência existente na molécula antiga;
  • o crescimento da cadeia sempre se dá na direção 5’-3’, ou seja, a enzima sempre adiciona um monofosfato de desoxirribonucleosídio (com o fosfato ligado ao carbono que ocupa a posição 5’ da pentose – C5’) a um C3’ livre de um nucleotídio preexistente;
  • DNA-polimerases não conseguem iniciar a síntese de novo, todas requerem um segmento inicial de nucleotídios (chamado primer) para dar continuidade à cadeia. Elas só conseguem alongar cadeias preexistentes, e não podem juntar dois desoxirribonucleotídios por meio da formação de uma ponte fosfodiéster inicial.

Em E. coli, a principal enzima na duplicação do DNA é a DNA-polimerase III (pol III), da qual existem apenas 10 moléculas por célula. A DNA-polimerase I (300 a 400 moléculas por célula) e a DNA-polimerase II (40 moléculas por célula) são mais abundantes na célula, uma vez que têm funções adicionais no processo de reparo do DNA ou como exonucleases, removendo nucleotídios já incorporados.

Células eucariontes apresentam, pelo menos, quatro DNA-polimerases localizadas no núcleo. As DNA-polimerases α e δ são responsáveis pela replicação do DNA nuclear e corresponderiam à polimerase III e E. coli. Durante a replicação do DNA nuclear, parece que essas duas enzimas, em uma conformação dimérica, exercem, exercem suas funções simultaneamente. Em função de suas características particulares, presumivelmente, a poli-δ replica a cadeia contínua enquanto a poli-α replica de maneira descontínua a outra cadeia a retardatária. A polimerase ε parece estar relacionada com os mecanismos de reparo, embora sua função precisa permaneça incerta. A quarta enzima de localização nuclear, a DNA-polimerase β é pequena e funciona no processo de reparo. Ainda existe a DNA-polimerase γ que é responsável pela replicação do DNA presente nas mitocôndrias.

 

OUTRAS ENZIMAS ESTÃO ENVOLVIDAS NA REPLICAÇÃO

Para que o processo de replicação ocorra, são necessárias muitas outras enzimas com funções específicas, além das DNA-polimerases.

Inicialmente é preciso desenrolar as voltas da dupla hélice de DNA para expor os moldes de cadeia simples á ação polimerase, problema mais complexo na cromatina das células eurariontes, mas também existente no DNA circular enovelado das células procariontes. O desenrolamento da dupla hélice é feito pela enzima helicase, que trabalha em cada forquilha de replicação, á frente da polimerase, desenrolando progressivamente as cadeias em ambas as direções. A ligação da helicase só ocorre após a ligação de uma proteína chamada de DnaA, que, inicialmente, causa a separação das cadeias nas origens de replicação. Como as duas cadeias de DNA da molécula original estão firmemente ligadas graças a numerosas pontes de hidrogênio entre suas bases.  O processo de desenrolamento envolve também a quebra das pontes de hidrogênio, para separar as duas cadeias da dupla hélice que vão ser copiadas. Nesse processo atua também a helicase, consumindo energia fornecida pelo ATP. A porção desenrolada de DNA deve ser então estabilizada, o que é feito com a participação de proteínas específicas, as proteínas SSP (Single strand proteins) que ao se ligarem às regiões de cadeias simples do DNA, mantém os filamentos separados, enquanto se processa a replicação. Essas proteínas impedem que as pontes de hidrogênio entre as bases se refaçam, depois de desfeitas pela helicase, evitam que essas regiões sofram torções, além de protegerem os filamentos simples da eventual degradação por nucleases.

Dadas as características da molécula de DNA, no entanto, o desenrolamento da dupla hélice no ponto de origem leva a um superenrolamento positivo do DNA mais adiante, e essas voltas adicionais na hélice ainda se acentuam mais a medida que a forquilha de replicação aumenta de tamanho. Para impedir que esse superenovelamento ocorra, entram em ação enzimas denominadas DNA-tropoisomerases, dentre as quais um dos tipos é conhecido como DNA-girase. Essas enzimas, para relaxarem o stresse contorcional imposto pelo desenrolamento, introduzem quebras, seguidas de reuniões das ligações fosfodiéster na molécula de DNA, suas ações também consomem energia fornecida pelo ATP.

Como mencionado anteriormente, as DNA-polimerases não conseguem iniciar a síntese de DNa sem o atuxílio de uma pequena sequência inicial ou primer, porque ela só é capaz de adicionar nucleotódios a um polinucleotídio preenxistente. Esses primers são seguntos curtos de RNA, com 1 a 60 nucleotídeos de comprimento, dependendo da espécie cuja sequencia é, naturalmente complementar à do DNA molde. Os primers que fazem parte dos pequenos fragmentos de Okazaki da cadeia descontínua sáo produzidos pela ação de uma RNA-polimerase especial, denominada primase. Nas células eucariontes, a atividade de primase está localizada em subunidades DNA-polimerase α, mas o primer para a cadeia geral, sintetizado pela RNA-polimerase que em geral sintetiza a RNA na transcrição. Nos dois casos, a DNA-polimerase catalisam a extensão do  primer, formando sempre na direção de 5´ para 3´ um filamento de DNA que contém de outras DNA-polimerases, que apresentam atividade exonuclease 5´, os primers de RNA são removidos e substituídos por desoxirrobonucleotídios. Os fragmentos agora completos são finalmente unidos por outra enzima, a DNA-ligase.

 

REPLICAÇÃO E REORGANIZAÇÃO DA FIBRA DE CROMATINA

Nas células eucariontes, como a DNA está ligado a protéin, constituindo a cromatina, não é a penas o DA que deve ser relicado na fase S, mas também nas histonas, como já mencionado. O processo replicativo envolve então a passagem do conjunto de enzimas da replicação através da molécula de DNA, que se apresenta organizada em nucleossomos. A fibra nucleossomicas certamente se se desorganiza durante essa passagem, mas ainda não se sabe se, nesse momento as histonas são completamente dissociadas do DNA. A montagem do DNA recém-duplicado em nucleossomos parece ocorrer logo atrás da forquilha de replicação de tal modo que, conforme esta avança a fibra nucleossômica vai sendo imediatamente reestruturada nas duas novas moléculas de DNA nascentes. Essa montagem é mediada por proteínas específicas que se ligam às histonas nucleossomicas e as transferem ao DNA, primeiramente, ocorrendo a associação dos tetrâmetros de histonas H3 e H4 seguida da associação de dímeros de H2A e H2B. Esses nucleossomos são formados tanto a partir de histonas recém-sintetizados em S como de histonas provenientes da desagregação de nucleossomos preexistentes, em uma combinação ao acaso.

 

CÉLULAS APRESENTAM MECANISMOS PARA MANTER INTEGRIDADE DO DNA

Apesar de complexa, a replicação do DNA é extremamente precisa, estimando-se que apenas um erro seja cometido na replicação de 108 bases. Essa precisão se dá principalmente a uma propriedade especial da DNA-polimerase: ela é capaz de conferir as bases, à medida que as adiciona ao novo filamento de DNA. Essa característica da enzima DNA-polimerase chama-se leitura de prova. A DNA-polimerase confere as bases adicionadas e remove imediatamente uma base errada, antes que a síntese do filamento de DNA continue. Seria como uma correção tipográfica em que a letra errado fosse corrigida antes de terminada a palavra inteira. No entanto, algumas bases incorretamente emparelhadas conseguem ainda assim, escapar dessa correlação de provas, e o DNA pode sair com defeitos dessa replicação, que não apresenta fidelidade absoluta.

Por outro lado, macromoléculas biológicas, são suscetíveis a alteração químicas que surgem de erros durante a síntese, ou mesmo de exposição a fatores deletérios do ambiente. O DNA sofre a ação de agentes físicos e de muitos agentes químicos, aguns produzidos normalmente na própria célula. Os raios cósmicos e outras radiações com muita energia podem causar lesões por atuação direta na DNA, como modificações nas bases ou ruptura da dupla cadeia. Também podem atuar indiretamente sobre o DNA, porque induzem o aparecimento de íons superóxido, quimicamente muito ativos. A radiação ultravioleta solar, embora tenha energia muito menor, também pode causar alterações como a formação de dímeros de timinas adjacentes na cadeia de DNA.

As células apresentam vários sistemas gerais para proteger seu DNA e outras moléculas. Os íons superóxido, por exemplo, são destruídos pela enzima superóxido-desmutase. Os íons H+ são neutralizados pelos sistemas reguladores do equilíbrio ácido-base e as oxidações intracelulares são reduzidas por diversos sistemas redutores, como o NADPH2  a glutationa e vitamina E.

Os danos causados ao DNA são particularmente graves porque o DNA constitui o material genético que contém todas as informações para a estrutura e para a atividades celulares. As alterações do DNA de uma célula somática são transmitidas às células filhas, podendo formar-se um clone de células modificadas. Quando as alterações do DNA ocorrem em uma célula germinativa (óvulo, espermatozoide out respectivos precursores) podem passar para as gerações futuras dos organismos atingidos, sendo seus efeitos ainda mais prejudiciais para a espécie. Em função dessa importância, além de ter alta fidelidade no processo de sua síntese o DNA é a única molécula que se danificada, pode ser reparada pela célula.

Os mecanismos de reparo são muito diversificados e, assim, a eficiência aumenta diante do tipo de lesão presente no DNA.

O reparo do DNA danificado é feito em duas fases: a primeira específica para cada tipo de defeito, e a segunda, de natureza geral, igual em todos os casos. A primeira fase é a identificação da alteração e a remoção das partes defeituosas da molécula. Essa fase vale-se de mecanismos diversos para identificar os diferentes defeitos e cortar, por meio de endonucleases (enzimas que cortam pedaços da parte central da molécula de DNA) o seguimento de DNA errôneo Na segunda fase, o segmento removido é substituído por um seguimento correto de DNA. De fato quando se colocam as células em presença de um precursor radioativo de DNA, com a timidina- H3, observa-se que ele é incorporado nas células interfásicas principalmente o período S, mas também, uma pequena incorporação é detectada ao longo de períodos não sintéticos, provavelmente relacionados com esses processos de reparo do DNA, que exigem determinado nível de síntese.

A importância biológica do reparo do DNA pode ser avaliada tanto pela quantidade de genes envolvidos no processo como pelas consequências em organismos que possuem células incapazes de reparar seu DNA. Exemplo do primeiro caso são as células da levedura que tem mais de 50 genes diferentes, cujos produtos participam do processo de reparo do DNA.