Mecanismos de reparo do DNA

Ciclo Celular

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Mecanismos de reparo do DNA

Evolutivamente, foram selecionadas várias estratégias para tolerar ou reparar danos causados no material genético celular. A seguir, vamos ver detalhes sobre quatro deles: os reparos por excisão de bases, por excisão de nucleotídeos, por recombinação e o reparo do emparelhamento errôneo de DNA.

 

REPARO POR EXCISÃO DE BASES

Dentre os vários mecanismos de reparo já descritos existem aqueles que atuam de forma a executar eficientemente a excisão completa dessas lesões. Sabe-se que bases oxidadas do DNA são primeiramente corrigidas pelo mecanismo de reparo por excisão de bases (BER – “base excision repair”), conhecido por atuar, principalmente, em modificações causadas por agentes endógenos. O mecanismo molecular do BER inicia-se, primeiramente, pelo reconhecimento e excisão de bases danificadas pelas DNA glicosilases sem ou com atividade 3’-AP liase associada. A excisão da base resulta em um sítio abásico (AP – apurínico ou apirimidínico) sem ou com incisão 3’, que é reconhecido por outro grupo de enzimas, as AP – endonucleases, que fazem a incisão na extremidade 3’ ou 5’ do sítio AP, gerando uma lacuna. Esta é preenchida através de polimerização e ligação de novos nucleotídeos à sequência de DNA.

 

REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS

O reparo por excisão de nucleotídeos (NER – “nucleotide excision repair”) é um dos mais importantes processos de reparo e tem sido intensamente estudado devido a sua versatilidade em operar, principalmente, em danos provocados por agentes exógenos que causam distorção da dupla-hélice do DNA, como por exemplo, aqueles causados por luz UV. O processo do NER em eucariontes envolve a ação de mais de 30 proteínas que atuam em 5 passos sucessivos: reconhecimento da lesão; abertura da dupla hélice de DNA onde está localizada a lesão; dupla incisão distante alguns nucleotídeos dos lados 5’ e 3’ do sítio da lesão; síntese do novo DNA utilizando como molde a fita não danificada e ligação da porção 5’ da nova fita sintetizada à cadeia pré-existente. O NER possui atividade heterogênea em regiões distintas do genoma e prossegue mais rapidamente e com maior fidelidade na fita transcrita de um gene ativo que na fita ou em um gene não transcrito. Esse processo, dependente da ação da RNA polimerase II (RNApolII), denomina-se reparo acoplado à transcrição (TCR), que assegura um rápido reparo dos genes ativos em contraponto com o reparo do genoma global (GGR), iniciado por um complexo de reconhecimento diferente.

 

REPARO POR RECOMBINAÇÃO

Outro mecanismo importante na proteção da molécula de DNA é o reparo por recombinação. Uma das lesões que pode ser reparada por esse mecanismo é a dupla quebra da cadeia de DNA criada por vários processos normais da célula ou por agentes exógenos, como irradiação ionizante. Existem dois caminhos envolvidos no reparo desse tipo de lesão: recombinação homóloga (HR – “homologous recombination”), que assegura um reparo bastante preciso; e junção de pontas não homólogas (NHEJ – “non-homologous end joining” ), sujeito a erro.

 

REPARO DO EMPARELHAMENTO ERRÔNEO DE DNA

O reparo do emparelhamento errôneo de DNA (MMR – “mismatch repair”) corrige pares errôneos de bases e alças desemparelhadas no DNA, eventualmente introduzidos por erros de replicação, ou lesões que interfiram com a atividade replicativa das DNA polimerases. Também está envolvido em meiose e recombinação. Atualmente muitos pesquisadores vêm propondo a existência de interação entre os diferentes mecanismos de reparo de DNA. Por exemplo, embora TCR tenha sido inicialmente descrito como sendo responsável pela remoção de lesões induzidas por luz UV, é hoje reconhecido por ser um fenômeno mais geral que opera em outros tipos de lesões no DNA. Entre essas, podemos citar as lesões oxidativas geradas por irradiação ionizante ou induzidas por ROS como timina glicol (Tg) e 8-oxo-7,8-diidroguanosina (8-oxoGuo)10. Outro exemplo pode ser a interação entre NER e MMR, onde MSH2 (“mismatch repair protein 2”), uma proteína conhecida por estar envolvida em MMR, foi descrita por interagir fisicamente com alguns componentes do NER. Dessa forma, o que se sugere é que os mecanismos de reparo de DNA, apesar das suas preferências por determinadas lesões, trabalham de uma forma bastante integrada.

 

 

A PROTEÍNA ATM E O CONTROLE DOS “CHECKPOINTS” DO CICLO CELULAR

Problemas genéticos que perturbam os mecanismos de reparo do DNA estão quase que invariavelmente associados a síndromes severas, normalmente caracterizadas pela degeneração de tecidos (especialmente do sistema nervoso e sistema imunológico), alta sensibilidade a certos agentes genotóxicos, envelhecimento precoce, instabilidade cromossômica, retardo no desenvolvimento, malformação e predisposição a câncer. Como exemplos dessas síndromes, podemos citar xeroderma pigmentosum (XP), síndrome de Cockayne (CS), tricotiodistrofia (TTD) – que são associadas a alterações no mecanismo de NER (reparo por excisão de nucleotídeos); síndrome de Bloom (BS) – ligada a problemas no reparo por recombinação homóloga; ataxia telangectasia (AT) – geneticamente descrita por apresentar mutação na proteína ATM (“ataxia telangectasia mutated”) associada ao mecanismo celular de resposta a lesões no DNA.

Atenção especial tem sido dada à proteína ATM, devido ao seu papel central na cascata de sinalização de uma das lesões mais citotóxicas, a quebra da dupla fita de DNA. Fenotipicamente os pacientes apresentam degeneração cerebelar – que leva a uma severa disfunção neuromotora progressiva-, imunodeficiência, instabilidade genômica, alta incidência de tumores malignos, sensibilidade à radiação ionizante e a agentes que induzem quebra da dupla fita de DNA.

A proteína ATM é homóloga a integrantes da família das fosfatidilinositol 3’-quinases e apresenta atividade quinase induzida por irradiação ionizante. Além disso, os membros dessa família, em vários aspectos, estão envolvidos na detecção de danos no DNA e controle da progressão do ciclo celular. Esse mecanismo de detecção e sinalização dos danos, conhecido como “checkpoint” (traduzido como pontos de verificação), representa a primeira resposta celular contra lesões no DNA, seguida da consequente ativação de uma rede intrincada de sinalização. Ao mesmo tempo, o “checkpoint” permite que as células parem o ciclo celular e ganhem tempo para reparar os danos, antes de recomeçar o ciclo e completar eventos subsequentes, como replicação de DNA e mitose. Recentemente, tem-se demonstrado que o controle de “checkpoints” também está envolvido em muitas outras vias, como no controle da ativação dos mecanismos de reparo de DNA, no posicionamento das proteínas de reparo no local do DNA lesado, no controle da transcrição gênica, no posicionamento e comprimento dos telômeros e, em alguns casos, na indução da morte celular via apoptose. Dessa forma, o checkpoint compreende uma sub-rota que integra não somente respostas a danos, mas também caminhos essenciais para a sobrevivência celular. Para ativar ao mesmo tempo tantas vias de sinalização existe um sofisticado sistema sensor e transdutor que converte, simultaneamente, o sinal celular de danos para vários efetores.

ciclo celular - mecanismos de reparo do DNA

As proteínas sensoras, que detectam inicialmente alterações na estrutura do DNA e iniciam o processo de sinalização, ainda são desconhecidas, mas existem muitos candidatos para essa função, como PARP (poli[ADP-ribose] polimerase), DNA-PK (proteína quinase dependente de DNA), BRCA1 (“breast cancer associated gene 1”), o complexo Nbs1-MRE11-RAD50, e as MSH2/6 (“mismatch repair protein” 2 e 6) e MLH2 (homóloga à proteína MutL de E. coli) que são proteínas envolvidas no reparo de bases desemparelhadas (MMR).

Ao contrário das proteínas sensoras, o conhecimento sobre o processo de transdução dos sinais de danos está um pouco mais avançado. No caso de dupla quebra no DNA, sabidamente gerada por irradiação ionizante ou por erro de replicação, a proteína ATM parece ter um papel central nesse sistema como sendo uma das primeiras transdutoras da presença do dano via fosforilação de vários efetores. O controle preciso e decisivo dessa proteína inicia-se com a ativação e estabilização de p53 que, entre suas atividades, atua como fator de transcrição. ATM também é capaz de fosforilar a histona H2AX, um processo que parece ser essencial no recrutamento de fatores de reparo, como RAD51 e BRCA1. Outro substrato da proteína ATM é a CHK2, uma proteína quinase relacionada ao “checkpoint” na transição da fase G1/S e da fase S e que, por sua vez, também fosforila p53. Além disso, ATM pode ativar a proteína BRCA1, que é uma das reguladoras do “checkpoint” das fases S e G2/M19. A lista de substratos alvos de ATM é bastante vasta e esses exemplos ilustram algumas vias de sinalização. Contudo, muitas respostas dependentes dessa proteína ainda são desconhecidas.

 

 

A PROTEÍNA ATM NA RESPOSTA AO ESTRESSE OXIDATIVO 

Alguns autores sugerem que a proteína ATM, além de estar envolvida na sinalização de quebra na dupla fita de DNA, também está envolvida na resposta celular a danos oxidativos, uma vez que células deficientes nessa proteína são hipersensíveis aos efeitos tóxicos do peróxido de hidrogênio, do óxido nítrico e do superóxido. Além disso, essas células re-sintetizam glutationa de uma forma extremamente lenta, após a depleção com maleato dietil. Mais ainda, camundongos que possuem mutação no gene ATM apresentam altos índices de estresse oxidativo, principalmente em tecidos alvo como o cerebelo, profundamente afetado em pacientes com ataxia telangectasia (AT).

Células deficientes no gene ATM não apresentam “checkpoints” relacionados às fases G1 e G2 ou indução de p53 após exposição ao agente oxidante t-butil-hidroperóxido, sugerindo que estes pontos de checagem sejam os momentos cruciais da sinalização a estresse oxidativo e da ativação dos subsequentes efetores do mecanismo de sinalização a esse tipo de lesões. Assim, os autores sugerem que a sensibilidade aumentada a agentes oxidantes de pacientes com AT está relacionada à falha do mecanismo de verificação.

Contudo, não se sabe ainda se ATM responde diretamente ao dano no DNA ou se responde às alterações do estado redox celular, independente do dano em si. Um bom exemplo dessa situação são os estudos realizados com tumores sólidos onde, internamente, a concentração de oxigênio varia consideravelmente. A reoxigenação de tumores provoca danos oxidativos detectáveis nesses tecidos, levando a uma resposta rápida de indução da sinalização de lesão no DNA. Esses autores sugerem que essa indução ocorre através da ativação de ATM via detecção de ROS, uma vez que, na ausência dessa proteína, há diminuição da fosforilação de p53. Contudo, ainda não se sabe ao certo quais são os agentes específicos que reconhecem os danos e ativam toda essa cascata de sinalização. Este é um dos pontos cruciais para elucidar os mecanismos que envolvem a sinalização celular de lesões oxidativas via ATM.

Hoje se admite que o controle dos “checkpoints”, que inicialmente se acreditava estar comprometido apenas com o controle da progressão do ciclo celular, parece ser um dos mecanismos que integram um conjunto de respostas celulares a danos no DNA. Contudo, o modo como os danos no DNA ativam os mecanismos de resposta celular é uma das principais questões a serem elucidadas nos próximos anos. Por exemplo, como os sensores reconhecem uma lesão? Existem sensores específicos para lesões específicas ou diferentes lesões podem ser reconhecidas por um número pequeno de sensores que são capazes de amplificar o sinal recrutando diferentes transdutores?

Outro ponto ainda bastante obscuro do mecanismo de resposta aos danos é a relação entre detecção do dano e recrutamento dos mecanismos de reparo de DNA. Como é feita a relação entre os sensores e as proteínas de reparo, uma vez que estas também necessitam ter acesso direto ao DNA? Seriam os danos no DNA em si os sinais ou seriam os processos de reparo que ativariam esse mecanismo de resposta? Da mesma forma que a célula tem um mecanismo que percebe os danos, não deveria ter também um mecanismo que percebe quando o DNA foi reparado para que a célula retome o seu metabolismo normal e volte a ter um ciclo completo? Se esse mecanismo é o próprio reparo ou se é algum outro mecanismo associado ao reparo, isso ainda precisa ser averiguado.

Outras questões estão relacionadas à ativação das proteínas quinases. Como é a regulação da ativação de uma determinada proteína em resposta a um certo dano? Como elas reconhecem um determinado substrato para a posterior fosforilação? Como é feita a seleção de substratos específicos? Apesar do considerável progresso no entendimento das respostas moleculares aos estresses celulares, muito ainda precisa ser estudado para um melhor entendimento da relação entre estresse celular, controle da transição do ciclo celular, reparo de DNA e decisão entre sobrevivência ou morte.

 

Referências
Berra CM, Menck CFM. Estresse oxidativo, lesões no genoma e processos de sinalização no controle do ciclo celular. Quim Nova. 2006; 29(6):1340-1344.

 

Controladores negativos do ciclo celular

A) As CKIs (cyclin kinase inhibitors) atuam sobre uma variedade de complexos CDK-ciclinas controlando a atividade desses complexos. O mecanismo pelo qual as CKIs atuam é dependente de sua concentração e não está completamente compreendido. Tem como principal função bloquear a fosforilação de proteínas pela quinase e parar o ciclo celular. Existem duas classes de CKIs:

  • Família CIP/KIP (proteína inibidora de quinase): incluem as proteínas com um domínio N-terminal inibidor, sendo as proteínas p21, p27 e p57. São inespecíficas (CKIs universais). Atuam evitando a ativação da quinase;
  • Família INK4 (inibidor de CDK): tem ação seletiva sobre o complexo ciclina D/CDK 4,6, sendo as proteínas p15, p16, p18 e p19. Ligam-se sobre a quinase proteica, evitando a sua interação com a ciclina D, inibindo assim a ativação da quinase.

B) O sistema ubiquitina de degradação de proteína atua na degradação das ciclinas, permitindo a transição de fases do ciclo. Normalmente, promovem a proteólise por meio da adição de cadeias de ubiquitina às moléculas de ciclina, que são então degradadas pelo proteossomo. Eventos mutacionais provocam a perda do sinal para degradação, levando à estabilização e expressão contínua das ciclinas.

C) As fosfatases específicas fazem a remoção do fosfato essencial para a ativação do complexo CDK-ciclina ou a adição de mais um fosfato também bloqueando a atividade da quinase.

 

Para que o ciclo celular seja iniciado, deve ocorrer o estímulo mitogênico adequado, que ocorre a partir da ligação de um fator de crescimento a um receptor específico na membrana plasmática, no citoplasma ou no núcleo. Esta ligação inicial desencadeia uma cascata de ativação de proteínas transdutoras de sinal, que enviam o sinal mitogênico até o núcleo, sendo genes-alvo aqueles codificadores das ciclinas e CDKs e genes essenciais para a síntese de desoxirribonucleotídeos e DNA.

Na ausência de fatores mitogênicos, as células são incapazes de ultrapassar o ponto de restrição em G1 e tornam-se quiescentes. O ponto de restrição pode ser considerado como um ponto crítico dentro do ciclo celular que precisa ser ultrapassado para que o ciclo ocorra de fato; uma vez ultrapassado, a célula torna-se comprometida a entrar na fase S. Qualquer mutação nos genes que codificam as proteínas dessa cascata pode resultar em alterações do ciclo e no desenvolvimento de alguns tipos de neoplasias. Dentre os principais fatores de crescimento celular estão os fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGF), fatores de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF) e insulina.

 

FASE G1

Após o estímulo de fatores mitogênicos, ocorre elevação dos níveis de ciclina D com formação do complexo envolvendo as quinases CDK4 e CDK6.

A proteína pRb (proteína do retinoblastoma) controla negativamente o ciclo nesta etapa. Ela ocorre em uma forma desfosforilada durante os dois primeiros terços da fase G1, antes que o ponto de restrição seja atingido. Enquanto pRb permanecer desfosforilada, ela restringe o crescimento celular bloqueando a progressão da célula

e evitando que ela ultrapasse o ponto de restrição da fase G1 para a fase S. No início

do ciclo, a pRb está ligada a um fator, o E2F, o que permite que ela não seja fosforilada, evitando assim a continuação do ciclo. Conforme o ciclo avança e a célula progride rumo à transição G1/S, a pRb é fosforilada pela CDK4 e 6, liberando o fator E2F. O E2F atua como fator de transcrição, estimulando a transcrição de genes envolvidos na progressão do ciclo celular, entre eles o da ciclina E, além de genes requeridos para a síntese de nucleotídeos e de DNA polimerase. Além disso, estimula o próprio E2F, em um sistema de retroalimentação positiva. A pRb é mantida fosforilada nas fases S, G2 e durante a mitose. Apenas após a mitose, quando os níveis de CDK-ciclina ficam muito reduzidos, ela volta ao seu estado ativo desfosforilada.

A proteína p53 é parte dos mecanismos de checkpoint da célula. Quando ocorrem mutações no DNA, ela interage com o ciclo celular na tentativa de identificar eventuais erros e permitir que estes sejam reparados. É um fator de transcrição que bloqueia o ciclo celular e impede a progressão para a fase S ou promove a morte celular. Entre seus efetores está a p21, capaz de inibir as CDKs responsáveis pela entrada na fase S. A produção aumentada de p21 vai bloquear a atividade de quinase do complexo ciclina/CDK; este, por sua vez, não vai fosforilar pRb, que não vai liberar o fator E2F e o ciclo vai parar. Esta interrupção no ciclo tem por finalidade permitir que o dano no DNA seja corrigido para que a célula continue sua divisão, ou então que a célula seja encaminhada à apoptose, caso o dano seja deletério e não sujeito a correções. Um outro controlador que atua ao término de G1 é a CKI p27, que irá bloquear a atividade de quinase do complexo ciclina E/CDK2, causando também uma pausa no ciclo celular.

 

FASE S

A entrada na fase S, vindo de G1, e a progressão de S para G2 dependem também do funcionamento dos complexos CDK-ciclina. Em G1 tardio, enquanto a expressão da ciclina E aumenta, estimulada pelo fator de transcrição E2F, os níveis de ciclina D são reduzidos por causa da diminuição da oferta de fatores de crescimento. Consequentemente, é reduzida a concentração dos complexos CDK4,6-ciclina D e aumentam os níveis de CDK2-ciclina E, cuja ativação promove a entrada da célula na fase S. Os mecanismos exatos envolvidos nesta etapa, entretanto, não são ainda compreendidos.

Na transição G1/S, a ciclina A começa a ser sintetizada, e os complexos CDK2-ciclina A mostram importante função imediatamente antes da síntese de DNA, fosforilando proteínas específicas envolvidas com as origens de replicação do DNA. As origens de replicação são regiões na fita de DNA que possuem características incomuns, como sequências consenso de nucleotídeos repetidos, que são reconhecidas por um complexo enzimático, iniciando o processo de replicação do DNA. Estas proteínas específicas são conhecidas como fatores licenciadores, os quais se ligam a determinados pontos da molécula de DNA, permitindo a deselicoidização da estrutura dupla-fita, a fim de que seja replicada. Os fatores licenciadores acumulam-se durante G1, atuam em S, e são destruídos em G2 para impedir nova replicação antes da mitose. Como são várias as origens de replicação (ou seja, a duplicação do material genético ocorre em vários locais simultaneamente), são igualmente importantes nesta fase os pontos de metilação. Eles sinalizam que determinada sequência da molécula já replicou, impedindo excesso de material duplicado.

Outro componente é o complexo mitótico CDK2-ciclina B ou Fator Promotor da Mitose (MPF). Ele permanece inativo durante toda a fase S e protege a célula de uma divisão antes que ela esteja totalmente pronta para isto. É importante salientar ainda a existência de um ponto de checagem na fase S, o qual também é induzido por danos no DNA, e envolve proteínas que regulam a atividade das CDKs, fatores de transcrição e proteínas de reparo.

 

FASE G2

Nesta fase, inicia-se a condensação da cromatina e a formação de estruturas bem definidas para que a célula possa progredir para a mitose. A principal quinase desta fase é a CDK1, que forma complexos tanto com a ciclina B quanto com a ciclina A. A CDK1 ativa-se quando é fosforilada, depois que isto ocorre, ela fosforila importantes substratos que serão cruciais na mitose. Além disso, a CDK1 contribui para a regulação do complexo promotor de anáfase (APC).

Para a célula progredir para a mitose é necessária a súbita ativação do complexo CDK2-ciclina B (ou MPF) pela desfosforilação, que ocorre na transição G2/M e resulta na fosforilação de muitas proteínas necessárias à mitose. Esse complexo é essencial para a entrada e a saída da fase M. Durante G2 e antes da entrada na fase M, CDK2 liga-se à ciclina B, formando um complexo que é fosforilado, permanecendo inativo. Quando esse complexo é, por fim, desfosforilado, ocorre sua ativação, e a mitose começa.

Dois pontos de checagem ocorrem um pouco antes ou durante a mitose. O primeiro deles ocorre em resposta a DNA não duplicado ou lesado, impedindo a ativação da CDK1 e bloqueando as células em G2/M. A p53 também atua nesse ponto de checagem inibindo o complexo CDK1-ciclina B. O segundo ponto de checagem envolve as proteínas das famílias BUB, MAD e Cdc20, impedindo o início da anáfase enquanto todos os cromossomos não mostrarem uma ligação correta ao fuso.

 

Relembrando o checkpoint
Quando não há ligação dos microtúbulos aos cinetócoros correspondentes ou quando não há tensão adequada na ligação, os cinetócoros produzem continuamente um sinal que ativa um mecanismo de checkpoint. A sinalização bioquímica culmina em interações moleculares entre MAD, BUB e o APC, atrasando a segregação cromossômica. MAD e BUB inativam o APC através de ligação direta ao Cdc20. O complexo MAD2/BUB1/Cdc20 constitui o complexo de checkpoint mitótico e impede o funcionamento do APC, retardando o início da anáfase até que todos os cinetócoros estejam adequadamente ligados aos microtúbulos.

 

Apesar do enorme conhecimento que tem sido gerado nos últimos anos acerca dos mecanismos que conduzem uma célula à duplicação e à segregação de seu material genético para as células-filhas, ainda há muitas questões a serem respondidas. O câncer se caracteriza pela proliferação descontrolada a partir de mutações em genes que controlam o ciclo celular. Alterações afetando a função de elementos reguladores como p16 (melanomas, linfomas, câncer de pulmão, pâncreas, etc), ciclina D (câncer de mama, de próstata, estômago, etc.), p53 (mama, ossos, colo, etc.) e pRb (principalmente o retinoblastoma, além de sarcoma e outros) são apenas alguns dos exemplos conhecidos da inter-relação entre câncer e regulação do ciclo celular. Para saber mais sobre a relação entre câncer e ciclo celular, leia nosso tópico Câncer e agentes anti-neoplásicos ligados ao ciclo celular.

Controladores positivos do ciclo celular

A progressão do ciclo celular depende de uma classe especial de enzimas do tipo quinase de serina/treonina, cuja subunidade catalítica é conhecida como CDK (cyclin-dependent kinase). São expressas durante todo o ciclo (isto é, são constitucionais), porém encontram-se na forma inativa. Só são ativadas quando ocorre a ligação entre elas e subunidades regulatórias chamadas ciclinas.

As ciclinas têm um padrão cíclico de acúmulo e degeneração, levando a uma variação periódica da sua concentração durante o ciclo. São sintetizadas somente em fases específicas, conforme a exigência (por isso são chamadas de facultativas) e, portanto, destruídas após a sua utilização. Ligam-se às CDKs para que possam exercer suas funções.

As CDKs e as ciclinas ativadas levam à progressão do ciclo celular, sendo os principais fatores positivos para a evolução do ciclo. A ativação das CDKs-ciclinas depende da fosforilação desse complexo; já a inativação do complexo pode se dar pela degradação de ciclina, adição ou remoção de fosfato, e pela ligação de CKIs (cyclin kinase inhibitors). A inter-relação entre ativação e desativação da atividade de CKs em várias etapas do ciclo é a chave para a progressão normal e para a regulação do ciclo celular, uma vez que cada fase oferece um ou mais pontos de controle específicos. A principal função do complexo CDK-ciclina é a fosforilação de várias outras proteínas em determinados estágios do ciclo.

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