Mecanismos de reparo do DNA
19 jun 2015

Mecanismos de reparo do DNA

Aprenda mais sobre os diversos mecanismos moleculares que garantem a estabilidade do material genético.

19 jun 2015

Evolutivamente, foram selecionadas várias estratégias para tolerar ou reparar danos causados no material genético celular. A seguir, vamos ver detalhes sobre quatro deles: os reparos por excisão de bases, por excisão de nucleotídeos, por recombinação e o reparo do emparelhamento errôneo de DNA.

 

REPARO POR EXCISÃO DE BASES

Dentre os vários mecanismos de reparo já descritos existem aqueles que atuam de forma a executar eficientemente a excisão completa dessas lesões. Sabe-se que bases oxidadas do DNA são primeiramente corrigidas pelo mecanismo de reparo por excisão de bases (BER – “base excision repair”), conhecido por atuar, principalmente, em modificações causadas por agentes endógenos. O mecanismo molecular do BER inicia-se, primeiramente, pelo reconhecimento e excisão de bases danificadas pelas DNA glicosilases sem ou com atividade 3’-AP liase associada. A excisão da base resulta em um sítio abásico (AP – apurínico ou apirimidínico) sem ou com incisão 3’, que é reconhecido por outro grupo de enzimas, as AP – endonucleases, que fazem a incisão na extremidade 3’ ou 5’ do sítio AP, gerando uma lacuna. Esta é preenchida através de polimerização e ligação de novos nucleotídeos à sequência de DNA.

 

REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS

O reparo por excisão de nucleotídeos (NER – “nucleotide excision repair”) é um dos mais importantes processos de reparo e tem sido intensamente estudado devido a sua versatilidade em operar, principalmente, em danos provocados por agentes exógenos que causam distorção da dupla-hélice do DNA, como por exemplo, aqueles causados por luz UV. O processo do NER em eucariontes envolve a ação de mais de 30 proteínas que atuam em 5 passos sucessivos: reconhecimento da lesão; abertura da dupla hélice de DNA onde está localizada a lesão; dupla incisão distante alguns nucleotídeos dos lados 5’ e 3’ do sítio da lesão; síntese do novo DNA utilizando como molde a fita não danificada e ligação da porção 5’ da nova fita sintetizada à cadeia pré-existente. O NER possui atividade heterogênea em regiões distintas do genoma e prossegue mais rapidamente e com maior fidelidade na fita transcrita de um gene ativo que na fita ou em um gene não transcrito. Esse processo, dependente da ação da RNA polimerase II (RNApolII), denomina-se reparo acoplado à transcrição (TCR), que assegura um rápido reparo dos genes ativos em contraponto com o reparo do genoma global (GGR), iniciado por um complexo de reconhecimento diferente.

 

REPARO POR RECOMBINAÇÃO

Outro mecanismo importante na proteção da molécula de DNA é o reparo por recombinação. Uma das lesões que pode ser reparada por esse mecanismo é a dupla quebra da cadeia de DNA criada por vários processos normais da célula ou por agentes exógenos, como irradiação ionizante. Existem dois caminhos envolvidos no reparo desse tipo de lesão: recombinação homóloga (HR – “homologous recombination”), que assegura um reparo bastante preciso; e junção de pontas não homólogas (NHEJ – “non-homologous end joining” ), sujeito a erro.

 

REPARO DO EMPARELHAMENTO ERRÔNEO DE DNA

O reparo do emparelhamento errôneo de DNA (MMR – “mismatch repair”) corrige pares errôneos de bases e alças desemparelhadas no DNA, eventualmente introduzidos por erros de replicação, ou lesões que interfiram com a atividade replicativa das DNA polimerases. Também está envolvido em meiose e recombinação. Atualmente muitos pesquisadores vêm propondo a existência de interação entre os diferentes mecanismos de reparo de DNA. Por exemplo, embora TCR tenha sido inicialmente descrito como sendo responsável pela remoção de lesões induzidas por luz UV, é hoje reconhecido por ser um fenômeno mais geral que opera em outros tipos de lesões no DNA. Entre essas, podemos citar as lesões oxidativas geradas por irradiação ionizante ou induzidas por ROS como timina glicol (Tg) e 8-oxo-7,8-diidroguanosina (8-oxoGuo)10. Outro exemplo pode ser a interação entre NER e MMR, onde MSH2 (“mismatch repair protein 2”), uma proteína conhecida por estar envolvida em MMR, foi descrita por interagir fisicamente com alguns componentes do NER. Dessa forma, o que se sugere é que os mecanismos de reparo de DNA, apesar das suas preferências por determinadas lesões, trabalham de uma forma bastante integrada.

 

 

A PROTEÍNA ATM E O CONTROLE DOS “CHECKPOINTS” DO CICLO CELULAR

Problemas genéticos que perturbam os mecanismos de reparo do DNA estão quase que invariavelmente associados a síndromes severas, normalmente caracterizadas pela degeneração de tecidos (especialmente do sistema nervoso e sistema imunológico), alta sensibilidade a certos agentes genotóxicos, envelhecimento precoce, instabilidade cromossômica, retardo no desenvolvimento, malformação e predisposição a câncer. Como exemplos dessas síndromes, podemos citar xeroderma pigmentosum (XP), síndrome de Cockayne (CS), tricotiodistrofia (TTD) – que são associadas a alterações no mecanismo de NER (reparo por excisão de nucleotídeos); síndrome de Bloom (BS) – ligada a problemas no reparo por recombinação homóloga; ataxia telangectasia (AT) – geneticamente descrita por apresentar mutação na proteína ATM (“ataxia telangectasia mutated”) associada ao mecanismo celular de resposta a lesões no DNA.

Atenção especial tem sido dada à proteína ATM, devido ao seu papel central na cascata de sinalização de uma das lesões mais citotóxicas, a quebra da dupla fita de DNA. Fenotipicamente os pacientes apresentam degeneração cerebelar – que leva a uma severa disfunção neuromotora progressiva-, imunodeficiência, instabilidade genômica, alta incidência de tumores malignos, sensibilidade à radiação ionizante e a agentes que induzem quebra da dupla fita de DNA.

A proteína ATM é homóloga a integrantes da família das fosfatidilinositol 3’-quinases e apresenta atividade quinase induzida por irradiação ionizante. Além disso, os membros dessa família, em vários aspectos, estão envolvidos na detecção de danos no DNA e controle da progressão do ciclo celular. Esse mecanismo de detecção e sinalização dos danos, conhecido como “checkpoint” (traduzido como pontos de verificação), representa a primeira resposta celular contra lesões no DNA, seguida da consequente ativação de uma rede intrincada de sinalização. Ao mesmo tempo, o “checkpoint” permite que as células parem o ciclo celular e ganhem tempo para reparar os danos, antes de recomeçar o ciclo e completar eventos subsequentes, como replicação de DNA e mitose. Recentemente, tem-se demonstrado que o controle de “checkpoints” também está envolvido em muitas outras vias, como no controle da ativação dos mecanismos de reparo de DNA, no posicionamento das proteínas de reparo no local do DNA lesado, no controle da transcrição gênica, no posicionamento e comprimento dos telômeros e, em alguns casos, na indução da morte celular via apoptose. Dessa forma, o checkpoint compreende uma sub-rota que integra não somente respostas a danos, mas também caminhos essenciais para a sobrevivência celular. Para ativar ao mesmo tempo tantas vias de sinalização existe um sofisticado sistema sensor e transdutor que converte, simultaneamente, o sinal celular de danos para vários efetores.

ciclo celular - mecanismos de reparo do DNA

As proteínas sensoras, que detectam inicialmente alterações na estrutura do DNA e iniciam o processo de sinalização, ainda são desconhecidas, mas existem muitos candidatos para essa função, como PARP (poli[ADP-ribose] polimerase), DNA-PK (proteína quinase dependente de DNA), BRCA1 (“breast cancer associated gene 1”), o complexo Nbs1-MRE11-RAD50, e as MSH2/6 (“mismatch repair protein” 2 e 6) e MLH2 (homóloga à proteína MutL de E. coli) que são proteínas envolvidas no reparo de bases desemparelhadas (MMR).

Ao contrário das proteínas sensoras, o conhecimento sobre o processo de transdução dos sinais de danos está um pouco mais avançado. No caso de dupla quebra no DNA, sabidamente gerada por irradiação ionizante ou por erro de replicação, a proteína ATM parece ter um papel central nesse sistema como sendo uma das primeiras transdutoras da presença do dano via fosforilação de vários efetores. O controle preciso e decisivo dessa proteína inicia-se com a ativação e estabilização de p53 que, entre suas atividades, atua como fator de transcrição. ATM também é capaz de fosforilar a histona H2AX, um processo que parece ser essencial no recrutamento de fatores de reparo, como RAD51 e BRCA1. Outro substrato da proteína ATM é a CHK2, uma proteína quinase relacionada ao “checkpoint” na transição da fase G1/S e da fase S e que, por sua vez, também fosforila p53. Além disso, ATM pode ativar a proteína BRCA1, que é uma das reguladoras do “checkpoint” das fases S e G2/M19. A lista de substratos alvos de ATM é bastante vasta e esses exemplos ilustram algumas vias de sinalização. Contudo, muitas respostas dependentes dessa proteína ainda são desconhecidas.

 

 

A PROTEÍNA ATM NA RESPOSTA AO ESTRESSE OXIDATIVO 

Alguns autores sugerem que a proteína ATM, além de estar envolvida na sinalização de quebra na dupla fita de DNA, também está envolvida na resposta celular a danos oxidativos, uma vez que células deficientes nessa proteína são hipersensíveis aos efeitos tóxicos do peróxido de hidrogênio, do óxido nítrico e do superóxido. Além disso, essas células re-sintetizam glutationa de uma forma extremamente lenta, após a depleção com maleato dietil. Mais ainda, camundongos que possuem mutação no gene ATM apresentam altos índices de estresse oxidativo, principalmente em tecidos alvo como o cerebelo, profundamente afetado em pacientes com ataxia telangectasia (AT).

Células deficientes no gene ATM não apresentam “checkpoints” relacionados às fases G1 e G2 ou indução de p53 após exposição ao agente oxidante t-butil-hidroperóxido, sugerindo que estes pontos de checagem sejam os momentos cruciais da sinalização a estresse oxidativo e da ativação dos subsequentes efetores do mecanismo de sinalização a esse tipo de lesões. Assim, os autores sugerem que a sensibilidade aumentada a agentes oxidantes de pacientes com AT está relacionada à falha do mecanismo de verificação.

Contudo, não se sabe ainda se ATM responde diretamente ao dano no DNA ou se responde às alterações do estado redox celular, independente do dano em si. Um bom exemplo dessa situação são os estudos realizados com tumores sólidos onde, internamente, a concentração de oxigênio varia consideravelmente. A reoxigenação de tumores provoca danos oxidativos detectáveis nesses tecidos, levando a uma resposta rápida de indução da sinalização de lesão no DNA. Esses autores sugerem que essa indução ocorre através da ativação de ATM via detecção de ROS, uma vez que, na ausência dessa proteína, há diminuição da fosforilação de p53. Contudo, ainda não se sabe ao certo quais são os agentes específicos que reconhecem os danos e ativam toda essa cascata de sinalização. Este é um dos pontos cruciais para elucidar os mecanismos que envolvem a sinalização celular de lesões oxidativas via ATM.

Hoje se admite que o controle dos “checkpoints”, que inicialmente se acreditava estar comprometido apenas com o controle da progressão do ciclo celular, parece ser um dos mecanismos que integram um conjunto de respostas celulares a danos no DNA. Contudo, o modo como os danos no DNA ativam os mecanismos de resposta celular é uma das principais questões a serem elucidadas nos próximos anos. Por exemplo, como os sensores reconhecem uma lesão? Existem sensores específicos para lesões específicas ou diferentes lesões podem ser reconhecidas por um número pequeno de sensores que são capazes de amplificar o sinal recrutando diferentes transdutores?

Outro ponto ainda bastante obscuro do mecanismo de resposta aos danos é a relação entre detecção do dano e recrutamento dos mecanismos de reparo de DNA. Como é feita a relação entre os sensores e as proteínas de reparo, uma vez que estas também necessitam ter acesso direto ao DNA? Seriam os danos no DNA em si os sinais ou seriam os processos de reparo que ativariam esse mecanismo de resposta? Da mesma forma que a célula tem um mecanismo que percebe os danos, não deveria ter também um mecanismo que percebe quando o DNA foi reparado para que a célula retome o seu metabolismo normal e volte a ter um ciclo completo? Se esse mecanismo é o próprio reparo ou se é algum outro mecanismo associado ao reparo, isso ainda precisa ser averiguado.

Outras questões estão relacionadas à ativação das proteínas quinases. Como é a regulação da ativação de uma determinada proteína em resposta a um certo dano? Como elas reconhecem um determinado substrato para a posterior fosforilação? Como é feita a seleção de substratos específicos? Apesar do considerável progresso no entendimento das respostas moleculares aos estresses celulares, muito ainda precisa ser estudado para um melhor entendimento da relação entre estresse celular, controle da transição do ciclo celular, reparo de DNA e decisão entre sobrevivência ou morte.

 

Referências
Berra CM, Menck CFM. Estresse oxidativo, lesões no genoma e processos de sinalização no controle do ciclo celular. Quim Nova. 2006; 29(6):1340-1344.

 

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